2×Taq PCR MasterMix

Premiscela per PCR rapida ad alta efficienza ed elevata resistenza allo stress.

2×Taq PCR MasterMix Ⅱ è una premiscela 2×PCR pronta per l'uso recentemente ottimizzata e aggiornata con tutte le parti essenziali nella reazione PCR, ad eccezione del modello di DNA e dei primer.

Gatto. No	Dimensione dell'imballaggio
4993001	1 ml
4993002	5x1ml
4992912	20x5x1 ml
4992913	5×1 ml
4992920	20×5×1 ml
4992921	20×5×1 ml

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Dettagli del prodotto

Esempio sperimentale

FAQ

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Caratteristiche

■ Elevata efficienza di amplificazione: frammenti di DNA di diverse dimensioni (inferiori a 5 kb) e sorgenti possono essere amplificati in modo efficiente.
■ Alta sensibilità: a partire da 10 pg di frammenti bersaglio possono essere amplificati da modelli genomici.
■ Elevata resistenza allo stress: per i modelli con un alto contenuto di impurità come il modello estratto in modo approssimativo/coltura batterica, il frammento target può essere facilmente amplificato. L'attività della polimerasi non sarà influenzata da ripetuti congelamenti e scongelamenti.
■ Comodo per le applicazioni: il sistema di reazione è stato preparato facilmente e rapidamente. Il frammento amplificato contiene la sporgenza dA dell'estremità 3', che è conveniente per la clonazione di TA.

Specifiche

Tipo: Taq DNA polimerasi
Campione: Modello purificato/estratto grezzo/coltura batterica
Modello: >10 pg
Dimensione del frammento: <5 kb
Applicazioni: Amplificazione PCR di frammenti di DNA, etichettatura del DNA, estensione del primer, determinazione della sequenza, rilevamento di geni su larga scala, esperimenti di PCR semiquantitativi, rilevamento di tracce di DNA, ecc.

Tutti i prodotti possono essere personalizzati per ODM/OEM. Per dettagli,fare clic su Servizio personalizzato (ODM/OEM)

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Figura 1. I modelli provenienti da diverse fonti sono stati amplificati rispettivamente da TIANGEN Taq MasterMix II e dal comune Taq Mix del fornitore TR per rilevare la resistenza allo stress dei reagenti. I risultati mostrano che i prodotti TIANGEN possono amplificare i frammenti bersaglio da modelli genomici grezzi e colture batteriche e la resistenza allo stress è migliore di quella del fornitore TR. A: Modello genomico grezzo estratto dal kit TIANGEN TIANcombi DNA Lyse&Det PCR. Prp/DN: Estrazione grezza e rilevamento di campioni di sangue umano. Riso: Estrazione grezza e rilevamento di campioni di riso. B: PCR di colonia. Il frammento PCR è di 700 bp.
M: TIANGEN Marker III

Buona universalità per modelli di diverse fonti e con diverse lunghezze
Figura 2. Frammenti di diverse sorgenti e lunghezze sono stati amplificati utilizzando TIANGEN Taq MasterMix II (A) e ordinario Taq Mix di Fornitore TK (B), Fornitore TR (C), Fornitore V (D) e Fornitore G (E) rispettivamente. I risultati mostrano che le prestazioni complete dei prodotti TIANGEN sono le migliori in termini di capacità di amplificazione, specificità e universalità.M: TIANGEN Marker III1: DNA genomico di soia modello (120 bp);

2-3: DNA genomico di riso (694 bp, 2258 bp);

4: Modello di DNA genomico del cotone (200 bp);

5: Escherichia coli modello di DNA genomico (2298 bp);

6-7: Modello di DNA del genoma di topo (1 kb, 2 kb);

8-10: Modello di DNA genomico di ratto (1 kb, 2 kb, 2080 bp);

11-18: Modello di DNA del genoma umano (300 bp, 448 bp (GC%: 74,8%), 1100 bp, 750 bp,

1000 bp, 1090 bp (GC%: 70,4%), 2 kb, 4 kb)

Alta sensibilità
Figura 3. Diverse concentrazioni di frammenti di DNA di ratto e umano sono state amplificate utilizzando TIANGEN Taq MasterMix II (A), ordinario Taq Mix di Supplier V (B) e Supplier TK (C), rispettivamente, per rilevare la sensibilità di amplificazione. I risultati mostrano che il prodotto TIANGEN potrebbe amplificare il frammento bersaglio dal modello genomico a partire da 0,01 ng e la sua sensibilità è migliore di quella dei prodotti del fornitore V e TK.M: TIANGEN Marker III, N: NTCTemplate input 1-8 : 200 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng.

D: Nessuna banda di amplificazione

Modello A-1

■ Il modello contiene impurità proteiche o inibitori Taq, ecc. ——Purificare il modello di DNA, rimuovere le impurità proteiche o estrarre il DNA modello con i kit di purificazione.

■ La denaturazione del templato non è completa ——Aumentare opportunamente la temperatura di denaturazione e prolungare il tempo di denaturazione.

■ Degrado del modello ——Ripreparare il modello.

A-2 Primer

■ Scarsa qualità dei primer ——Risintetizzare il primer.

■ Degradazione del primer ——Aliquotare i primer ad alta concentrazione in un piccolo volume per la conservazione. Evitare il congelamento e lo scongelamento multiplo o la crioconservazione a lungo termine a 4°C.

■ Progettazione inadeguata dei primer (es. lunghezza del primer non sufficiente, dimero formato tra i primer, ecc.) - Riprogettazione dei primer (evitare la formazione di dimero di primer e struttura secondaria)

A-3 mg²⁺concentrazione

■ Mg²⁺ la concentrazione è troppo bassa ——Aumentare adeguatamente Mg²⁺concentrazione: Ottimizza il Mg²⁺ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale²⁺ concentrazione per ogni stampo e primer.

A-4 Temperatura di ricottura

■ L'elevata temperatura di ricottura influisce sul legame del primer e del modello. ——Ridurre la temperatura di ricottura e ottimizzare la condizione con un gradiente di 2°C.

A-5 Tempo di estensione

■ Tempo di estensione breve: aumenta il tempo di estensione.

D: Falso positivo

Fenomeni: i campioni negativi mostrano anche le bande della sequenza bersaglio.

A-1 Contaminazione della PCR

■ Contaminazione incrociata della sequenza target o dei prodotti di amplificazione ——Fare attenzione a non pipettare il campione contenente la sequenza target nel campione negativo oa versarli fuori dalla provetta da centrifuga. I reagenti o l'attrezzatura devono essere sterilizzati in autoclave per eliminare gli acidi nucleici esistenti e l'esistenza di contaminazione deve essere determinata mediante esperimenti di controllo negativo.

■ Contaminazione dei reagenti ——Aliquotare i reagenti e conservarli a bassa temperatura.

A-2 Primor

■ Mg²⁺ la concentrazione è troppo bassa ——Aumentare adeguatamente Mg²⁺ concentrazione: Ottimizza il Mg²⁺ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale²⁺ concentrazione per ogni stampo e primer.

■ Progettazione del primer non corretta e la sequenza target ha omologia con la sequenza non target. ——Riprogettazione dei primer.

D: Amplificazione non specifica

Fenomeni: le bande di amplificazione della PCR non sono coerenti con le dimensioni previste, sia grandi che piccole, o talvolta si verificano sia bande di amplificazione specifiche che bande di amplificazione non specifiche.

A-1 Primer

■ Scarsa specificità del primer

——Riprogettazione del primer.

■ La concentrazione di primer è troppo alta ——Aumentare adeguatamente la temperatura di denaturazione e prolungare il tempo di denaturazione.

A-2 mg²⁺ concentrazione

■ Il Mg²⁺ la concentrazione è troppo alta ——Ridurre adeguatamente la concentrazione di Mg2+: ottimizzare il Mg²⁺ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale²⁺ concentrazione per ogni stampo e primer.

A-3 Polimerasi termostabile

■ Quantità eccessiva di enzima ——Ridurre la quantità di enzima in modo appropriato a intervalli di 0,5 U.

A-4 Temperatura di ricottura

■ La temperatura di ricottura è troppo bassa ——Aumentare opportunamente la temperatura di ricottura o adottare il metodo di ricottura a due fasi

A-5 cicli PCR

■ Troppi cicli PCR ——Ridurre il numero di cicli PCR.

D: Bande irregolari o macchiate

A-1 Primer——Scarsa specificità ——Riprogettare il primer, modificare la posizione e la lunghezza del primer per migliorarne la specificità; o eseguire la PCR nidificata.

A-2 DNA modello

——Il modello non è puro ——Purificare il modello o estrarre il DNA con i kit di purificazione.

A-3 mg²⁺ concentrazione

——Mg²⁺ la concentrazione è troppo alta ——Ridurre adeguatamente Mg²⁺ concentrazione: Ottimizza il Mg²⁺ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale²⁺ concentrazione per ogni stampo e primer.

A-4 dNTP

——La concentrazione di dNTP è troppo alta ——Ridurre adeguatamente la concentrazione di dNTP

A-5 Temperatura di ricottura

——Temperatura di ricottura troppo bassa ——Aumentare opportunamente la temperatura di ricottura

A-6 Cicli

——Troppi cicli ——Ottimizza il numero di cicli

D: Quanto DNA stampo deve essere aggiunto in un sistema di reazione PCR da 50 μl?

D: Come amplificare lunghi frammenti?

Il primo passo è scegliere la polimerasi appropriata. La normale Taq polimerasi non può correggere le bozze a causa della mancanza di attività esonucleasica 3'-5' e la mancata corrispondenza ridurrà notevolmente l'efficienza di estensione dei frammenti. Pertanto, la normale Taq polimerasi non può amplificare efficacemente i frammenti bersaglio più grandi di 5 kb. La Taq polimerasi con modifica speciale o altra polimerasi ad alta fedeltà dovrebbe essere selezionata per migliorare l'efficienza dell'estensione e soddisfare le esigenze di amplificazione di frammenti lunghi. Inoltre, l'amplificazione di frammenti lunghi richiede anche la corrispondente regolazione del disegno del primer, del tempo di denaturazione, del tempo di estensione, del pH del tampone, ecc. Di solito, i primer con 18-24 bp possono portare a una resa migliore. Per evitare danni al templato, il tempo di denaturazione a 94 °C deve essere ridotto a 30 secondi o meno per ciclo e il tempo per aumentare la temperatura a 94 °C prima dell'amplificazione deve essere inferiore a 1 minuto. Inoltre, l'impostazione della temperatura di estensione a circa 68°C e la progettazione del tempo di estensione in base alla velocità di 1 kb/min possono garantire un'efficace amplificazione di frammenti lunghi.

D: Come migliorare la fedeltà di amplificazione della PCR?

Il tasso di errore dell'amplificazione PCR può essere ridotto utilizzando varie DNA polimerasi ad alta fedeltà. Tra tutte le Taq DNA polimerasi trovate finora, l'enzima Pfu ha il più basso tasso di errore e la più alta fedeltà (vedi tabella allegata). Oltre alla selezione degli enzimi, i ricercatori possono ridurre ulteriormente il tasso di mutazione della PCR ottimizzando le condizioni di reazione, compresa l'ottimizzazione della composizione del tampone, la concentrazione della polimerasi termostabile e l'ottimizzazione del numero del ciclo della PCR.

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