2 × Miscela PCR Pfu

Taq DNA polimerasi ultra pura ad alta fedeltà.

La DNA polimerasi Pfu è espressa da E.coli con il gene Pyrococus Furiosis DNA polimerasi clonato e purificata e separata mediante purificazione su più colonne. Poiché Pfu ha un'attività di esonucleasi 3'-5', può correggere le bozze nel processo di amplificazione del DNA, mentre la tradizionale Taq DNA polimerasi non può. Sebbene altre DNA polimerasi Taq come Vent, Deep Vent, Tli, UITma, ecc. abbiano funzioni di correzione di bozze, Pfu ha il tasso di mancata corrispondenza più basso tra tutte le DNA polimerasi Taq trovate finora. Pfu DNA polimerasi ha una migliore stabilità termica rispetto alla comune Taq DNA polimerasi e può mantenere più del 90% di attività a 95 ° C per 1 ora.

Mix Pfu PCR a un tubo (certificazione nazionale del prodotto high-tech)

■ La miscela Pfu PCR ha migliorato la specificità e la sensibilità della reazione PCR e può amplificare modelli complessi con un alto contenuto di GC, struttura secondaria e simili. È possibile amplificare fino a 2 copie del modello target, garantendo risultati sperimentali più accurati.

■ L'esclusiva formula Pfu MasterMix rende l'intero sistema di reazione molto stabile e l'attività non sarà influenzata da ripetute gelate e disgelo o dalla conservazione a lungo termine a 4°C.

■ La soluzione di miscelazione PCR pre-preparata stabile ed efficiente può rendere l'operazione rapida e semplice, riducendo notevolmente l'intensità del lavoro e l'errore di campionamento. Nella miscela sono inclusi anche un potenziatore e un ottimizzatore della PCR ad alte prestazioni, il che riduce i requisiti sulle condizioni della PCR.

■ Questo prodotto dispone di sistemi sia contenenti coloranti che privi di coloranti. I prodotti PCR Mix contenenti coloranti possono essere sottoposti a elettroforesi direttamente dopo la PCR, senza l'aggiunta di tampone campione.

Gatto. No Dimensione dell'imballaggio
4992780 1 ml
4992781 5*1 ml
4992782 1 ml
4992906 5*1 ml

Dettagli del prodotto

Flusso di lavoro

FAQ

Tag dei prodotti

Definizione di attività

L'attività di 1 unità (U) Pfu DNA polimerasi è definita come la quantità di enzima necessaria per incorporare 10 nmol di deossinucleotidi in sostanze insolubili in acido a 74°C entro 30 minuti utilizzando DNA spermatico di salmone attivato come stampo/primer.

Controllo di qualità

La purezza mediante rilevamento SDS-PAGE è superiore al 99%; Non viene rilevata alcuna attività della nucleasi esogena; Il gene a copia singola nel genoma umano potrebbe essere amplificato in modo efficace; Nessun cambiamento significativo di attività se conservato a temperatura ambiente per una settimana.

Parametri tecnici principali

Ha attività esonucleasica 3'-5' e nessuna attività esonucleasica 5'-3'. La velocità di estensione dell'amplificazione del DNA è inferiore a quella della Taq polimerasi e generalmente la velocità di estensione dell'enzima Pfu è di 0,5-1 kb al minuto. La stabilità termica di Pfu è migliore di Taq. Per modelli con alto contenuto di GC, la temperatura di denaturazione può essere aumentata a 98°C, il che non ha alcun effetto sull'attività della Pfu polimerasi. Il prodotto della PCR è smussato, che può essere aggiunto con sporgenze 3'-dA prima della legatura con il vettore TA o clonato con il vettore smussato

Applicazioni

Può essere utilizzato per l'amplificazione ad alta fedeltà del DNA, come la clonazione dell'espressione genica, la mutazione sito-diretta, l'analisi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) e la riparazione delle estremità.

Tutti i prodotti possono essere personalizzati per ODM/OEM. Per dettagli,fare clic su Servizio personalizzato (ODM/OEM)


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    Experimental ExampleExperimental Example Utilizzare il DNA genomico come modello per amplificare il frammento di 1kb.
    Dopo la reazione PCR, prendere 5 μl per il rilevamento dell'elettroforesi.
    D: Nessuna banda di amplificazione

    Modello A-1

    ■ Il modello contiene impurità proteiche o inibitori Taq, ecc. ——Purificare il modello di DNA, rimuovere le impurità proteiche o estrarre il DNA modello con i kit di purificazione.

    ■ La denaturazione del templato non è completa ——Aumentare opportunamente la temperatura di denaturazione e prolungare il tempo di denaturazione.

    ■ Degrado del modello ——Ripreparare il modello.

    A-2 Primer

    ■ Scarsa qualità dei primer ——Risintetizzare il primer.

    ■ Degradazione del primer ——Aliquotare i primer ad alta concentrazione in un piccolo volume per la conservazione. Evitare il congelamento e lo scongelamento multiplo o la crioconservazione a lungo termine a 4°C.

    ■ Progettazione inadeguata dei primer (es. lunghezza del primer non sufficiente, dimero formato tra i primer, ecc.) - Riprogettazione dei primer (evitare la formazione di dimero di primer e struttura secondaria)

    A-3 mg2+concentrazione

    ■ Mg2+ la concentrazione è troppo bassa ——Aumentare adeguatamente Mg2+ concentrazione: Ottimizza il Mg2+ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale2+ concentrazione per ogni stampo e primer.

    A-4 Temperatura di ricottura

    ■ L'elevata temperatura di ricottura influisce sul legame del primer e del modello. ——Ridurre la temperatura di ricottura e ottimizzare la condizione con un gradiente di 2°C.

    A-5 Tempo di estensione

    ■ Tempo di estensione breve: aumenta il tempo di estensione.

    D: Falso positivo

    Fenomeni: i campioni negativi mostrano anche le bande della sequenza bersaglio.

    A-1 Contaminazione della PCR

    ■ Contaminazione incrociata della sequenza target o dei prodotti di amplificazione ——Fare attenzione a non pipettare il campione contenente la sequenza target nel campione negativo oa versarli fuori dalla provetta da centrifuga. I reagenti o l'attrezzatura devono essere sterilizzati in autoclave per eliminare gli acidi nucleici esistenti e l'esistenza di contaminazione deve essere determinata mediante esperimenti di controllo negativo.

    ■ Contaminazione dei reagenti ——Aliquotare i reagenti e conservarli a bassa temperatura.

    A-2 Primor

    ■ Mg2+ la concentrazione è troppo bassa ——Aumentare adeguatamente Mg2+ concentrazione: Ottimizza il Mg2+ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale2+ concentrazione per ogni stampo e primer.

    ■ Progettazione del primer non corretta e la sequenza target ha omologia con la sequenza non target. ——Riprogettazione dei primer.

    D: Amplificazione non specifica

    Fenomeni: le bande di amplificazione della PCR non sono coerenti con le dimensioni previste, sia grandi che piccole, o talvolta si verificano sia bande di amplificazione specifiche che bande di amplificazione non specifiche.

    A-1 Primer

    ■ Scarsa specificità del primer

    ——Riprogettazione del primer.

    ■ La concentrazione di primer è troppo alta ——Aumentare adeguatamente la temperatura di denaturazione e prolungare il tempo di denaturazione.

    A-2 mg2+ concentrazione

    ■ Il Mg2+ la concentrazione è troppo alta ——Ridurre adeguatamente la concentrazione di Mg2+: ottimizzare il Mg2+ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale2+ concentrazione per ogni stampo e primer.

    A-3 Polimerasi termostabile

    ■ Quantità eccessiva di enzima ——Ridurre la quantità di enzima in modo appropriato a intervalli di 0,5 U.

    A-4 Temperatura di ricottura

    ■ La temperatura di ricottura è troppo bassa ——Aumentare opportunamente la temperatura di ricottura o adottare il metodo di ricottura a due fasi

    A-5 cicli PCR

    ■ Troppi cicli PCR ——Ridurre il numero di cicli PCR.

    D: Bande irregolari o macchiate

    A-1 Primer——Scarsa specificità ——Riprogettare il primer, modificare la posizione e la lunghezza del primer per migliorarne la specificità; o eseguire la PCR nidificata.

    A-2 DNA modello

    ——Il modello non è puro ——Purificare il modello o estrarre il DNA con i kit di purificazione.

    A-3 mg2+ concentrazione

    ——Mg2+ la concentrazione è troppo alta ——Ridurre adeguatamente Mg2+ concentrazione: Ottimizza il Mg2+ concentrazione mediante una serie di reazioni da 1 mM a 3 mM con un intervallo di 0,5 mM per determinare il Mg . ottimale2+ concentrazione per ogni stampo e primer.

    A-4 dNTP

    ——La concentrazione di dNTP è troppo alta ——Ridurre adeguatamente la concentrazione di dNTP

    A-5 Temperatura di ricottura

    ——Temperatura di ricottura troppo bassa ——Aumentare opportunamente la temperatura di ricottura

    A-6 Cicli

    ——Troppi cicli ——Ottimizza il numero di cicli

    D: Quanto DNA stampo deve essere aggiunto in un sistema di reazione PCR da 50 μl?
    ytry
    D: Come amplificare lunghi frammenti?

    Il primo passo è scegliere la polimerasi appropriata. La normale Taq polimerasi non può correggere le bozze a causa della mancanza di attività esonucleasica 3'-5' e la mancata corrispondenza ridurrà notevolmente l'efficienza di estensione dei frammenti. Pertanto, la normale Taq polimerasi non può amplificare efficacemente i frammenti bersaglio più grandi di 5 kb. La Taq polimerasi con modifica speciale o altra polimerasi ad alta fedeltà dovrebbe essere selezionata per migliorare l'efficienza dell'estensione e soddisfare le esigenze di amplificazione di frammenti lunghi. Inoltre, l'amplificazione di frammenti lunghi richiede anche la corrispondente regolazione del disegno del primer, del tempo di denaturazione, del tempo di estensione, del pH del tampone, ecc. Di solito, i primer con 18-24 bp possono portare a una resa migliore. Per evitare danni al templato, il tempo di denaturazione a 94 °C deve essere ridotto a 30 secondi o meno per ciclo e il tempo per aumentare la temperatura a 94 °C prima dell'amplificazione deve essere inferiore a 1 minuto. Inoltre, l'impostazione della temperatura di estensione a circa 68°C e la progettazione del tempo di estensione in base alla velocità di 1 kb/min possono garantire un'efficace amplificazione di frammenti lunghi.

    D: Come migliorare la fedeltà di amplificazione della PCR?

    Il tasso di errore dell'amplificazione PCR può essere ridotto utilizzando varie DNA polimerasi ad alta fedeltà. Tra tutte le Taq DNA polimerasi trovate finora, l'enzima Pfu ha il più basso tasso di errore e la più alta fedeltà (vedi tabella allegata). Oltre alla selezione degli enzimi, i ricercatori possono ridurre ulteriormente il tasso di mutazione della PCR ottimizzando le condizioni di reazione, compresa l'ottimizzazione della composizione del tampone, la concentrazione della polimerasi termostabile e l'ottimizzazione del numero del ciclo della PCR.

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